Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового
синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение
3 — 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 %
растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через
спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать
при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся
недолго.
Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.
Вместо метиленового синего можно воспользоваться
карбол-фуксином либо как таковым, либо в разведенном виде (1:10). Окрашивание
длится от 15—30 секунд до 2—3 минут, в зависимости от степени разведения
перекрашивания допускают дифференцировку 70° спиртом (10—20—30 секунд).
Окраска основным фуксином по Пфейферу. 1 г основного фуксина растворяют в 10—15 мл
этилового спирта и смешивают со 100 мл 5 % раствора фенола. Затем 3 капли
полученного раствора добавляют к 10 мл дистиллированной, воды и этой смесью
окрашивают мазки в течение 30 — 40 мин. После этого ополаскивают водой,
дифференцируют 0,1 % раствором соляной кислоты в абсолютном спирте,
ополаскивают в абсолютном спирте и заключают в бальзам.
Результат: бактерии окрашиваются в малиново-красный цвет.
Для ориентировочной окраски бактерий можно
воспользоваться также карболовым генциановым фиолетовым или кристаллическим
фиолетовым. Однако эти красители при дифференцировке 700 спиртом
легче извлекаются из клеточных элементов и бактерий, чем фуксин, поэтому,
пользуясь ими, рекомендуется сильно перекрашивать.
Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора
генцианового фиолетового (генцианвиолет) со 100 мл 2,5 % раствора фенола
(смесь хранится долго). Мазки окрашивают в течение 2 — 5 мин через
фильтровальную бумагу, промывают в проточной воде, сушат и исследуют при
масляной иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в густо-фиолетовый цвет.
Смешивают 1 часть насыщенного спиртового раствора
тионина с 10 частями 1 % водного раствора фенола, мазки окрашивают 3 - 5 мин,
ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 30 секунд в 96 % спирте, снова
ополаскивают в воде и высушивают. Препарат изучают при масляной иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в темно-синий цвет.
Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху:
1,2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96 % спирта и добавляют
100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл
анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Вместо
кристаллического фиолетового можно использовать метиловый фиолетовый.
1) 10 г кристаллического фиолетового + 100 мл
спирта;
2) 10 г генцианового фиолетового +100 мл спирта;
3) 10 г метилового фиолетового + 100 мл спирта;
4) 1 мл насыщенного спиртового раствора
кристаллического фиолетового + 10 мл дистиллированной воды;
5) 0,25 мл насыщенного спиртового раствора
кристаллического фиолетового +100 мл 5 % раствора уксусной кислоты;
6) 8 - 9 г метиленового синего +100 мл спирта;
7) 30 мл насыщенного раствора метиленового синего
в спирте + 1 г гидроксида калия + 99 мл дистиллированной воды.
1) 8 — 9 г основного фуксина + 100 мл 96 % спирта;
2) 1 мл насыщенного спиртового раствора основного
фуксина + 10 мл дистиллированной воды;
3) 1 г основного фуксина +1 г фенола + 0,5 мл
глицерина + 10 мл 96 % спирта +100 мл дистиллированной воды;
4) 0,2 — 0,5 % водный раствор сафранина либо 0,25
% раствор сафранина в 10 % спирте.
1. Мазки крови, цереброспинальной жидкости,
экссудатов фиксируют над пламенем горелки (быстро проводят 3 раза над
пламенем, так чтобы мазок прогревался до 70-800С в течение 3-4 с),
затем высушивают. Кроме фиксации над огнем, для мазков применима фиксация в
метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коплина) в течение
15 мин.
2. Наливают на фиксированный мазок карболовый или
анилиновый генциановый фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) на 2—3
минуты. Во избежании осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Очень
удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной
1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной.
Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают
дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2—3
мин.).
3. Сливают краску, аккуратно удаляют
фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15—30
секунд).
4. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя иди
другим йодистым раствором, например по Граму (2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл
дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300
мл, а по Вейгерту до
100 мл дистиллированной воды).
5. Раствор сливают, мазок промывают водой
(водопроводной или дистилированной).
6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая
его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно
20-40-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают.
Если вместо спирта использовать ацетон, то
промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона
(1:1) 30 с.
7. Промывают стекла в проточной или
дистиллированной воде 1 — 2 мин.
8. Дополнительно окрашивают (для выявления
грамотрицательной группы бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального
красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля —
1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25
% раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J
или В (2-5 мин).
9. Промывают в проточной воде 5 с и
высушивают фильтровальной бумагой.
Результат: Грамположительные бактерии окрашиваются в
иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные - в красный или
коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток — ярко-красные, цитоплазма
— розовая.
Следует заметить, что в классической прописи при
окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски
генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки
раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое
промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни
в какой мере не отражается на результатах окрашивания.
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков
разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки
окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с
увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной
воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка
(коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта
и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется
плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100
мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации.
Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве
растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так
как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно
применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом
прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте,
окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного
раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин
(продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным
буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 —
6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного
плазмодия — 7,0 — 7,2.
2. Ополаскивают в дистиллированной воде,
высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет,
цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный.
Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые
после окрашивания фуксином не обесцвечиваются под действием концентрированных
минеральных кислот и спиртов. Особенностью этой группы бактерий является их
невосприимчивость к красителям, поэтому для их окрашивания применяют
подогретые концентрированные красители. Наиболее распространен метод
Циля-Нильсена.
Для приготовления раствора карболового фуксина 1 г
основного фуксина растворяют в 2 мл глицерина и доливают до 100 мл 5 %
раствором фенола. Р. Лилли (1969) рекомендует следующую пропись: в 50 мл
спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить
дистиллированной водой до 500 мл.
1. Наливают на фиксированный мазок карбол-фуксин Циля
(окрашивают через фильтровальную бумагу) и подогревают над пламенем спиртовки
до появления паров. Эту температуру поддерживают в течение 1—2 минуты, не
доводя до кипения.
2. Сливают краску, удаляют фильтровальную бумагу и
основательно промывают в водопроводной воде.
3. Дифференцируют 1% солянокислым спиртом (на 70°
спирте) до тех пор, пока мазок не примет бледно-розовый или бледно-фиолетовый
тон (примерно 30—60 секунд).
4. Промывают в воде 15-30 и более секунд.
5. Докрашивают метиленовым синим Лефлера 15-30
секунд.
6. Основательно споласкивают в воде и высушивают
фильтровальной бумагой.
Мазки, перекрашенные метиленовым синим, можно
дифференцировать 70° спиртом.
Такое простое окрашивание мазков на микобактерии
туберкулеза практически имеет наибольшее значение. Наряду с ним, но
значительно реже, применяются и другие
способы: метод обогащения, посевы, прививки животным.
Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или
синем фоне.
